Metode Penelitian Maserasi dan Fraksinasi Bertingkat Oleoresin
Oleoresin adalah suatu campuran antara minyak atsiri dan resin yang memiliki aroma dan pembawa yang tidak mudah menguap. Oleoresin mempunyai kumpulan senyawa kimia dengan susunan kimia yang cukup komplek. Oleoresin berwujud cairan kental yang mengandung kadar minyak atsiri 15-35%.
Menurut Evania (2019) oleoresin merupakan hasil ekstraksi rempah yang di dalamnya terkandung komponen-komponen utama pembentuk perisa berupa zat volatil (minyak atsiri) dan non-volatil (resin dan gum), masing-masing komponen berperan dalam menentukan aroma dan rasa.
Oleoresin dari rempah-rempah mempunyai banyak manfaat yaitu untuk industri makanan dan minuman, farmasi, parfum, pewarna, dan lain sebagainya. Pemakaian oleoresin cukup luas, sehingga dibutuhkan produksi oleoresin yang terus meningkat.
Maserasi merupakan suatu metode ekstraksi yang dilakukan melalui perendaman serbuk bahan larutan pengekstrak yang digunakan untuk mengekstrak zat aktif yang mudah larut dalam cairan pengekstrak, tidak mengembang dalam pengekstrak, dan tidak mengandung benzoin (Hargono, 1986). Metode maserasi terdiri dari digesti, pengadukan kontinyu, remaserasi, dan maserasi melingkar (Hargono, 1986).
Fraksinasi merupakan proses pemisahan antara zat cair dengan zat cair. Fraksinasi dilakukan secara bertingkat berdasarkan tingkat kepolarannya yaitu dari non polar, semi polar, dan polar. Senyawa yang memiliki sifat non polar akan larut dalam pelarut non polar seperti eter, kloroform, dan n-heksana, sifat semi polar akan larut dalam pelarut semi polar, dan yang bersifat polar akan larut kedalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, dan air.
Pelarut yang berisfat polar mampu mengekstrak senyawa alkaloid kuartener, komponen fenolik, karotenoid, tanin, gula, asama amino, dan glikosida. Pelarut non polar mampu mengesktrak senyawa kimia seperti lilin, lipid, dan minyak yang mudah menguap (Putranti, 2013).
Ekstrak yang telah dilarutkan dalam pelarut, nantinya akan dimasukkan ke dalam corong pisah dan dicampur dengan pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya. Setelah itu corong pisah dikocok. Setelah dikocok, akan terbentuk dua lapisan. Pelarut yang memiliki massa jenis lebih tinggi akan berada di lapisan bawah, dan yang memiliki massa jenis lebih kecil akan berada di lapisan atas. Senyawa yang terkandung dalam ekstrak nantinya akan terpisah sesuai dengan tingkat kepolarannya sama dengan senyawa tersebut (Suwendiyanti, 2014).
Berikut Metode Penelitian Maserasi dan Fraksinasi Bertingkat Oleoresin adalah.
Baca juga: Metode Penelitian Biomassa dan Karbon
A. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, gelas bekker, desikator, timbangan analitik, kantong plastik, maserator, spatula/pengaduk, kertas saringan, corong kaca, saringan, ayakan mesh 40 dan 60, pipet ukur, gelas erlenmeyer, rotary evaporator, water bath, corong pisah, statif, botol vial, piknometer, mikropipet, buret 25 ml, hotplate, pipet tetes, vortex mixer, stirrer mekanik, tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan petri, Laminar Air Flow (LAF), autoclave, penggaris/mistar, pinset, botol semprot, lampu spiritus, kain biru, dan GC-MS.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 500 gram serbuk daun B.frutescens L. dalam kondisi kering, pelarut etanol, n-heksana, kloroform dan etil asetat, aquades 1000 ml, etanol 96%, 40 tetes phenolphthalein 1%, 0,1 KOH, 0,5 KOH, 0,5 N HCL, isolat jamur P. ostreatus, kentang 200 g, dextross 17 g, bubuk agar 30 g, tissue 1 pc, kapas 250 g, DMSO, spiritus, alkohol, kertas aluminium foil, kertas label, plastik wrap, dan obat jamur 0,03 g Dithane M-45 WP.
B. Prosedur Penelitian
1. Persiapan Bahan
a. Pengambilan Daun B. frutescens L.
Daun B.frutescens L. diperoleh dari daerah Kereng Bangkirai Kecamatan Sebangau Kota Palangka Raya Kalimantan Tengah. Daun diambil sebelum matahari terbit, dimana tumbuhan B.frutescens L. belum mengalami fotosintesis. Daun yang masihsegar disimpan dalam kantungan plastik.
b. Pembuatan Simplisia
Daun segar itu dikeringkan pada ruangan laboratorium Manajemen Hutan Jurusan Kehutanan. Daun dikering udarakan sampai diperoleh kadar air tidak lebih dari 10-15% (Zahra et al., 2019). Daun yang kering diblender, kemudian diayak dengan ukuran partikel lolos 40 mesh tertahan di mesh 60. Serbuk daun yang dibutuhkan 500 gram.
Pengukuran kadar air bertujuan untuk mengetahui banyaknya kandungan air dalam bahan baku. Pengukuran diawali dengan menimbang masing-masing sampel 2 gram sebagai berat awal kemudian dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 103 ± 2 derajat celsius selama 4 jam. Mendinginkan sampel dalam desikator selama ±15 menit. Kadar air daun B. frutescens L. dapat dihitung dengan rumus (Haygreen dan Bowyer, 1989).
Kadar Air (%) = (BB-BKT)/BKT x 100%
Keterangan:
BKT: Berat Kering Tanur
2. Maserasi dan Fraksinasi
Simplisia daun B.frutescens L. sebanyak 500 gram dimaserasi dengan etanol menggunakan perbandingan 1:5. Setiap 24 jam sekali dilakukan pengadukan supaya serbuk terlarut dengan pelarut etanol sampai diperoleh filtrat bening pada suhu ruangan (tekanan 1 atm).
Larutan disaring menggunakan kertas saring yang diletakkan diatas corong kaca dan ditampung dalam erlenmeyer. Larutan ekstrak etanol yang diperoleh di evaporasi dengan rotary evaporator pada suhu 45-50 derajat Celsius sampai pelarut tidak menetes lagi. Larutan ekstrak hasil evaporasi diletakkan di atas water batch 45-50 derajat celsius bertujuan untuk menguapkan sisa-sisa pelarut di dalam ekstrak dan diperoleh hasil ekstrak yang kental (Setiawan et al., 2019).
Proses selanjutnya ± 10 g ekstrak etanol di fraksinasi dengan pelarut pertama n-heksana. Proses fraksinasi terdiri dari campuran ekstrak kasar, pelarut, dan aquades dengan menggunakan perbandingan 1:2:2. Campuran ekstrak kasar dikocok dalam corong pemisah selama 10-15 menit kemudian dibiarkan sampai terjadi pemisahan antara ekstrak dengan n-heksana. Tahap pemisahan ini memperoleh filtrat fraksi n-heksana dan residu.
Residu n-heksana yang diperoleh difraksinasi bertingkatkan dengan pelarut kloroform. Kebutuhan pelarut kloroform sama dengan kebutuhan pelarut n-heksana. Campuran residu dengan pelarut kloroform dikocok selama 10-15 menit, kemudian dibiarkan sampai terjadi pemisahan. Tahap pemisahan ini memperoleh filtart fraksi kloroform dan residu.
Residu klorofom yang diperoleh difraksinasi bertingkatkan dengan pelarut etil asetat. Kebutuhan pelarut etil asetat sama dengan kebutuhan pelarut n-heksana. Campuran residu dengan pelarut etil asetat dikocok selama 10-15 menit, kemudian dibiarkan sampai terjadi pemisahan. Tahap pemisahan ini memperoleh filtart fraksi etil asetat dan residu. Masing-masing filtart fraksi yang diperoleh dievaporasi menggunakan rotary evaporator untuk menguapkan sisa-sisa pelarut dan menghasilkan ekstrak kental (Setiawan et al., 2019).
3. Uji Fisika Kimia
a. Rendemen
Perhitungan rendemen oleoresin masing-masing pelarut dilakukan dengan cara menimbang simplisia daun B.frutescens L. sebelum diekstraksi dan berat ekstrak hasil ekstraksi. Besarnya rendemen dihitung dengan rumus (Setiawan et al., 2019).
R (%) = A/B x 100%
Keterangan:
A: Berat ekstrak (gram)
B: Berat serbuk sebelum diekstrak (gram)
Baca juga: 5 Faktor Mempengaruhi Metode Ekstraksi Oleoresin
b. Bobot Jenis
Cara penentuan bobot jenis menggunakan alat piknometer. Mencuci piknometer, kemudian membilas dengan etanol, keringkan bagian dalam piknometer. Timbang piknometer kosong menggunakan timbangan analitik. Bobot jenis oleoresin merupakan perbandingan dari berat sampel (oleoresin) dengan berat air dalam volume dan suhu yang sama. Volume 2 ml aquades yang diambil dengan mikropipet dan ditimbang beratnya. Selanjutnya mengambil 2 ml oleoresin (masing-masing ekstrak larutan) dengan mikropipet dan ditimbang beratnya. Besarnya bobot jenis dihitung dengan rumus (Guenther, 1990).
Bobot Jenis = (berat 2 ml oleoresin)/(berat 2 ml air (aquades) + 0,0007 (T1-T)
Keterangan:
T1= Suhu Pengerjaan (derajat celsius)
T= Suhu referensi (20 derajat celsius)
c. Kelarutan dalam Etanol
Sampel oleoresin (masing-masing ekstrak larutan) diambil sebanyak 1 ml, masukkan dalam tabung reaksi. Etanol 96% ditambahkan sedikit demi sedikit sampai terbentuk larutan jernih. Setiap kali penambahan alkohol, tabung dikocok atau digoyang-goyang. Kelarutan dalam alkohol dinyatakan dalam jumlah alkohol yang dibutuhkan untuk melarutkan 1 ml oleoresin. Kelarutan dalam etanol dinyatakan sebagai berikut (Guenther, 1990):
Kelarutan dalam 96% etanol = 1 volume dalam Y volume
d. Bilangan Asam
Sampel oleoresin (masing-masing ekstrak larutan) sebanyak ± 1 gram, dimasukkan dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 15 ml etanol 96% dan 5 tetes indikator phenolphthalein 1%. Titrasi dengan larutan 0,1 N KOH yang telah distandarisasi sampai berubah warna asalnya yang tidak hilang selama 10 detik. Besarnya bilangan asam dinyatakan sebagai berikut (Guenther, 1990):
Bilangan Asam = (N KOH x V KOH x 56,1)/(berat sampel (gram))
Keterangan:
V NaOH = Volume titrasi NaOH (ml)
e. Bilangan Ester
Bilangan ester adalah kelanjutan dari bilangan asam. Campuran tersebut ditambah dengan 10 ml 0,5 N KOH, kemudian refluks selama ± 1,5 jam, dan dinginkan selama ± 15 menit. Titrasi dengan menggunakan 0,5 N HCl dan 5 tetes phenolphthalien 1% sampai berubah warna. Besarnya bilangan ester dinyatakan sebagai berikut (Guenther, 1990):
Bilangan Ester = (V blanko-V sampel)x N HCl x 56,1)/(berat sampel (gram))
Keterangan:
V sampel = Volume titrasi bilangan asam (ml)
N HCl = Normalitas HCL (N)
C. Analisis Komponen Senyawa Oleoresin dengan GC-MS
Oleoresin yang diperoleh dilanjutkan pada analisis senyawa dengan menggunakan Gas Chromatography – Mass Spectometry (GC-MS) yang terdapat dalam sampel oleoresin. Tujuannya untuk mengetahui senyawa yang terdapat didalamnya. Komponen dicacah pada detektor dan direkam dalam recorder sehingga didapatkan pembacaan berupa peak area yang menunjukkan persentase area dari komponen yang di analisis.
Masing-masing puncak dari kromatografi dilihat spektrum massanya lalu dianalisis kandungan senyawanya dengan cara membandingkan spektrum tersebut dengan data analisa standar SRM (Standard Reference Material) yang ada pada Standard Library Spectra. Identifikasi analit terhadap Standard Library Spectra dinyatakan dengan persen kemiripan dan keduanya dinyatakan identik jika komputer menilai persen keduanya diatas 90%.
Baca juga: 5 Pelarut dalam Ekstraksi Oleoresin
Sumber:
Evania, M. K. 2019. Studi Literatur Berbagai Metode Ekstraksi Oleoresin pada Biji Pala, Lada, dan Jahe. UNIKA Soegijapranata Semarang.
Guenther, E. 1990. Minyak Atsiri Jilid I. Ketaren (penerjemah). UI Press. Jakarta.
Hargono. D. 1986. Sediaan Galenik. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan (BPOM). Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.
Haygreen, J. G., & Bowyer, J. L. 1989. Hasil Hutan dan Ilmu Kayu, suatu Pengantar Hadikusumo, S. A. Prawirohatmodjo, S. (penerjemah). Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Putranti, R. I. 2013. Skrining Fitokimia dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Rumput Laut Sargassum duplicatum dan Turbinaria ornata dari Jepara. Tesis. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, UNDIP. Semarang.
Setiawan, A., Farah, D., & Evy, W. 2019. Uji Aktivitas Antijamur Ekstrak Daun Api-api (Avicennia maria Vierh) untuk Menghambat Pertumbuhan Jamur Schizophyllum commune Fries. Jurnal Hutan Lestari. 7 (1): 517-524. https://jurnal.untan.ac.id/index.php/jmfkh/article/download/32376/75676580832
Suwendiyanti, R. 2014. Efektifitas Ekstrak Akar, Batang, Kulit Batang, Daun, dan Fraksi Avicennia marina sebagai Antioksidan. Skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Universitas Padjajaran. Jatinagor.
Zahra, A. M., Budiastra, I. W., Sugiyono, S., & Mardjan, S. S. 2019. Sifat Fisikokimia Oleoresin Fuli Pala Hasil Ekstraksi Berbantu Ultrasonik Pada Metode Pengeringan yang Berbeda. Warta Industri Hasil Pertanian, 36(1), 1-10.
Lamboris Pane